3). C'est par la mise en commun de technologies pluridisciplinaires telles que la micro-mécanique, la micro-optique, la micro-chimie que l'on peut s'attendre à un nouvel essor au cours des prochaines années. Fonctionnement et Descriptif (1,4)








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titre3). C'est par la mise en commun de technologies pluridisciplinaires telles que la micro-mécanique, la micro-optique, la micro-chimie que l'on peut s'attendre à un nouvel essor au cours des prochaines années. Fonctionnement et Descriptif (1,4)
date de publication28.01.2017
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Thierry Vivier

Florian Convers

juin 1998 Licence de Biologie

IST

LES BIO-PUCES

ET LEURS APPLICATIONS

Le diagnostique moléculaire est en plein bouleversement: méthodes alternatives à la PCR, nouveaux supports pour la fixation de sondes ... et une nouvelle technologie: les puces à ADN.

Issues d'une combinaison de technologie pluridisciplinaire, telle que la micro-électronique, la chimie, la biologie moléculaire ainsi que l'informatique, elles
ont ouvert de nouvelles perspectives pour le séquençage, l'analyse de mutations, l'expression des gènes mais aussi dans l'agro-alimentaire, le contrôle des organismes génétiquement modifiés.

Ce sont donc toutes ces possibilités qui ont conduit les scientifiques à se tourner vers ce concept qui risque de révolutionner le monde de la biologie moléculaire.
Historique
Suite au coût éventuel du projet de séquençage du génome humain ainsi qu'à l'échec relatif de son automatisation, un grand nombre de projet ayant pour but l'accélération et la simplification de cette tache ont vu le jour (1).

C'est l'apparition de puces à ADN dont les précurseurs furent les matrices de sondes à haute densité (2), qui a permis de redonner un nouveau souffle à ce gigantesque projet. La technologie de ces puces, bien que toutes assez récentes (1987) permettent déjà d'attendre des améliorations décisives au cours des années à venir. En effet, bien que leurs degrés de perfection actuels soient des plus remarquables, leurs extraordinaires étendues sont en grande partie due à leur rapidité ainsi qu'aux multiples horizons qui peuvent leurs être attribués. Les puces à ADN sont pour la plupart, dans leur concept le plus simple, le fruit du couplage de différentes techniques de miniaturisation dérivées de l'électronique (les masques photolitographiques et différentes techniques de dépôt par jet) mais aussi de la chimie des nucléotides (greffes de sondes oligonucléotidiques) (3).

C'est par la mise en commun de technologies pluridisciplinaires telles que la micro-mécanique, la micro-optique, la micro-chimie que l'on peut s'attendre à un nouvel essor au cours des prochaines années.
Fonctionnement et Descriptif (1,4)
Leurs fonctionnements peuvent être très simplifiés mais nécessitent néanmoins une série d'étapes incontournables : la construction de puces, la préparation des sondes, l'hybridation avec les cibles et la lecture de l'empreinte d'hybridation suivie du traitement du signal.

Fig. 1 - Hybridation sur puce à ADN


La réaction cardinale qui s'opère dans les puces à ADN est celle là même qui, découverte par Watson et Crick a fondé la biologie moléculaire, à savoir, l'hybridation entre séquences nucléotidiques complémentaires. C'est à dire une fois synthétisés, des oligonucléotides (simple brin) greffés sur la puce constituent les sondes dont le rôle est de détecter des cibles
1
complémentaires, marquées par fluorescence et présentes dans le mélange complexe à analyser,
Les sondes sont, soit déposées par une tête d'impression commandée par un robot, soit synthétisées in situ. L'élément principal de la puce à ADN est l'unité d'hybridation appelée Plot lequel, présent en un grand nombre d'exemplaire, possède une adresse connue et correspond, par exemple à un gène indexé dans un catalogue. Après hybridation et lavage, le signal moyen de chaque plot est enregistré grâce à un microscope confocal. Enfin le traitement numérique du signal permet d'établir la concentration exacte des cibles duplexées et forme l'empreinte d'hybridation.

Les dimensions du plot représente actuellement l'une des limites des puces à ADN qui se répercute sur leur densité (Nombre de plot/unité de surface), ainsi que leur complexité (nombre de gènes ciblés) (3). Par exemple, les procédés mis au point à ce jour permettent d'obtenir des densités de plot de l'ordre de 1015 à 10^6 plotS/CM2 et dont l'équivalent en ARNM peut correspondre à l'ensemble des ARNM d'un type cellulaire donné (10 000 à 50 000). La taille des sondes représente une seconde limite à ce procédé (aujourd'hui 10-20 nt/sondes). En effet, l'utilisation de sondes de tailles supérieures conduit à la formation de boucles (autohybridation) qui empêche l'hybridation avec les cibles (1).

La Phase de fabrication et de fixation des sondes (1,4)
Le fonctionnement des puces à ADN est basé sur le phénomène d'hybridation, à savoir, l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences de nucléotides. Cette hybridation forme un duplex (Double brin). Le brin dont on conna¼t la séquence, intégrale ou partielle, constitue la sonde et celui que l'on souhaite caractériser est la cible. L'utilisation de l'hybridation, n'est pas nouvelle. En effet la PCR, les différents blots (Northern, Southern et Dot) notamment, utilisent ce principe. L'originalité des puces est la constitution de l'hybridation sur phase solide, permettent de travailler simultanément avec un nombre de sondes considérables, dont les positions sont parfaitement connues.
Les puces actuelles diffèrent par les techniques de fabrication et de fixation des sondes qui peuvent être classé selon deux écoles:

- La fixation de oligonucléotides déjà synthétisés

- La synthèse in situ
La fixation d'oligonucléotides déjà synthétisés

- Par adressage mécanique
En 1989, les chercheurs de l'institut de Biologie Moléculaire de Moscou ont évoqué l'idée de

fixer des oligonucléotides sur des plots de, gel de polyacrylamide activés. Les oligonucléotides nécessaires sont prélevés et placés sur les plots par l'intermédiaire d'une micropipette robotisée.
Fig. 2 - Adressage mécanique

Par adressage électrochimique

Développée en France par Cis Bio International en partenariat avec le CEA de Grenoble, cette méthode d'adressage consiste à activer spécifiquement une microéléctrode de 50 m en or et cela afin d'adresser une séquence définie d'oligonucléotides. On réalise sur chaque électrode une éléctro-polymérisation entre un pyrolle normal et un pyrolle sur lequel a été fixé un oligonucléotide de façon covalente.
Fig. 3 - Adressage électrochimique
La synthèse in situ
Par adressage Photochimique

Ce principe développé par les Hollandais d'Affymax utilise la synthèse in situ. Des groupements photolabiles protègent les groupements réactifs qui interviennent dans la liaison avec le nucléotide. A l'aide de masques on découvre spécifiquement certains plots et on y fixe un nucléotide donné qui possède lui aussi un groupement photolabile chargé de protéger

1
la liaison avec le nucléotide suivant. Les oligonucléotides sont synthétisés de façon combinatoire avec l'utilisation successive de différents masques photolitographiques de formes définies.
Fig. 4 - Adressage pmtochimique

Cette technique est connue sous le nom de VLSIPS (Very Large Scale Imobilised Polymer Synthesis) et est aujourd'hui la plus avancée. Cette technique permet de synthétiser rapidement un grand nombre de nucléotides différents. Par exemple, pour une sonde longue de huit nucléotides, il existe 4^8 séquences différentes, soit 65 536 combinaisons. Dans le cadre de la synthèse en Bandes orthogonales, l'application successives de 32 masques permet de toutes les synthétiser. D'autres techniques permettent d'abaisser le nombre de masques nécessaires (Synthèse binaire).
FIG 4
Une autre innovation intéressante conçue par Nanogène utilise le pilotage électronique de l'hybridation. Sur cette puce chaque microéléctrode crée un champ électrique qui dans un
premier temps favorise l'hybridation et accélère la réaction par une concentration éléctrophorétiques des cibles autour de la sonde et dans un second temps via une inversion de courant, répulse les sondes non ou mal hybridées limitant ainsi le risque de mesappariements. Pour les autres puces, les méthodes de stringence classiques (Salinité, température, Ph) sont utilisées.
La lecture de 1'hybridation (1,4,5)
La phase de lecture de la puce suit la phase d'hybridation. Il s'agit ici de repérer ce qui a été effectivement hybridé, c'est à dire de repérer à quelle adresse les sondes sont complémentaires des cibles de l'échantillon test. Lors de la phase de lecture, un laser excite les molécules fluorescentes liées au cibles hybridées et un microscope confocal lié à un ordinateur capte et analyse la lumière émise par l'excitation de ces molécules. Cela aboutit à une empreinte d'hybridation.

On peut se réjouir en remarquant les progrès effectués au niveau de la détection de l'hybridation. En effet, l'ancienne méthode de détection, dite classique risque d'être remplacée par un procédé qui rendant au terme de puce son aspect électronique, permet, grâce à des phénomènes physiques dont la quantification est possible, l'analyse de courants locaux résultants de l'hybridation, lesquels sont détectés par des semi-conducteurs qui constituent le support de fixation des sondes.

Fig. 6 - Analyse de, l'empreinte d'hybridation


Les champs d'application (1,6,7,10)
Trois champs d'application s'offrent aux puces à ADN:

0 L'analyse de mutations

0 L'analyse de l'expression des gènes

0 Le séquençage par hybridation
L'analyse de mutations

On utilise dans ce cas une sonde de référence correspondant à la séquence sauvage avec en parallèle, plusieurs sondes identiques à une mutation prés. Ces sondes vont couvrir l'ensemble des mutations potentielles (substitution, délétion, addition). De manière générale, l'analyse de substitutions implique donc l'utilisation de quatre sondes, une pour la séquence sauvage et trois pour chacun des nucléotides pouvant se substituer au nucléotide original.
Cette tâche s'effectue par des comparaisons de détection de sondes hybridées avec des séquences de l'échantillon testé par rapport à celle résultante de l'échantillon sauvage, le tout combiné avec une méthode faisant appel au double marquage fluorescent.

Un tel procédé a été appliqué afin de détecter des mutations hétérozygotes dans l'exon 11 du gène BRCA1 (7). Cette détection mettant en place des ensemble redondants et chevauchants de 14 sondes de nucléotides correspondant chacune à des types de mutations différentes e Deux sondes sauvages

· Trois sondes pour les substitutions potentielles en position centrale.

· Trois sondes pour les insertions de 1 nucléotide en position centrale-

* Cinq sondes pour des délétions en position centrale.

Enfin, pour s'affranchir des différences de conditions d'hybridation, le nucléotide étudié aura une position centrale sur la sonde.

Une fois la sonde constituée, un double marquage fluorescent qui en vert (fluorescéine) correspond au type sauvage et en rouge (Coerythrine et streptavidine) associé aux ARN test. C'est après une analyse de l'empreinte d'hybridation que l'on peut apprécier les quantités ARN de référence ou testé. C'est par un tel procédé qu'ont pu être mis en évidence après l'étude de 15 échantillons test 14 mutations connues ainsi que 8 nouveaux polymorphismes. Les puces à ADN furent aussi utilisées dans le cadre des recherches concernant les mutations de la protéase du VIH (Cible de nombreux antiviraux). C'est grâce aux puces utilisées au cours de cette expérience que l'on a pu mettre en évidence que l'acquisition de la résistance du VIH vis à vis des médicaments résultait d'un polymorphisme naturel et non d'un phénomène adaptatif Une puce spécifiquement dédiée à l'étude des mutations de ce gène est d'ailleurs commercialisée par Affimetrix sous le nom de Gene Chip Tm HIV PRT (8).
Fig. 7- Principe de la puce Gene Chip HIV P
Le même principe de puce est actuellement utilisé pour le séquençage des mutations éventuelles du Virus de l'Hépatite C (9).

Ne pouvant s'appliquer que sur des brins déjà séquences, l'analyse de mutations se voit aussi toutes dédier à l'ADN mitochondriale qui, n'est présent chez un individu en une unique version moléculaire (L'ADN mitochondrial est d'origine maternelle).

L'analyse de l'expression des gènes
En effet une autre application majeure des puces à est l'étude de ce que 1'on peut appeler le " transcriptome ". Dans un cas général, les sondes sont formées d'ARN complémentaires, utilisées de façon redondante , c'est à dire que la représentation d'un gène se fait par environ 300 paires de sondes de 20 nucléotides. La paire étant utile pour le contrôle d'hybridation. Une des deux sondes est sauvage, tandis que l'autre est mutée en position centrale.

Deux principes de mesure de l'expression des gènes peuvent être distingués

Le premier faisant appel à la comparaison à des cibles standards ajoutées dans l'extrait Le second étant le résultat de l'analyse successive par la même puce d'un échantillon test et d'un échantillon de référence les deux étant marques par des fluorochromes différents De nouveaux procédés mis au point par Affimetrix permettent de détecter une concentration minimale de 1 :300000 et devrais d'ici peu atteindre une complexité de plusieurs dizaine de milliers de gènes.


Le séquençage
Les limitations de la technique de séquençage de Sanger amenèrent les chercheurs à trouver une méthode de séquençage, pour séquencer plus et plus vite. Les puces semblaient toute dédiée à cette utilisation.

En effet, lorsque l'on a très peu d'informations sur une séquence, la synthèse des sondes en masse est nécessaire. Et les puces facilitent grandement cette tâche.

Dans le séquençage par hybridation, une séquence nucléotidique linéaire est considérée comme un ensemble de sous-séquences chevauchantes dont la détermination simultanée et le réassemblage au moyen d'un programme informatique spécifique permet, la reconstitution de la séquence étudiée.

Etant donnée l'invariabilité des sondes fixées aux puces dans le cadre du séquençage, une industrialisation de ces dernières serait possibles et faciliterait grandement la tache des

laboratoires. Cependant, il existe plusieurs obstacles à cette ouverture. Les répétitions, nombreuses dans le génome humain constituent un obstacle au séquençage par hybridation, en empêchant le calcul d'une solution unique dans la réorganisation des séquences chevauchantes.

L'équipe du biologiste Russe A.D. Mirzabekov, cherchant à contrecarrer le problème des répétitions de séquence, a opté pour la mise au point de puces de capacité supérieure qui une fois couplée au principe de double hybridation, affranchit la séquence de doutes éventuels sur son intégrité (3).

Un autre concept d'analyse développé par A.B. Chetverin et F.R. Kramer semble surmonter pour de bon cet obstacle. En effet, en plus du principe de séquençage par hybridation, on
associe le principe classique de séparation selon la taille, dont la judicieuse combinaison permet, malgré l'analyse de séquences d'ADN complexes d'éviter l'étape de clonage.

Un exemple d'application actuelle (6)
L'utilisation de signature génétique connue pour identifier des délétions et observer le phénotype des souches sous diverses pressions de sélection est un exemple montrant la grande simplification des protocoles rendue possible par l'utilisation des puces à ADN.
Le Principe
Les souches mutantes sont construites par recombinaison homologue entre un fragment d'ADN contenant un marqueur de sélection dominant (Kan R), la séquence signature unique de 20 pb ainsi qu'un site commun permettant une PCR ultérieure, et un cadre ouvert de lecture, correspondant au gène à déléter.

Le panel des souches mutantes est mis en culture parallèle sur différents milieux de culture. Chaque milieu de culture est analysé à différents temps.

L'exemple de Shoemaker porte sur 11 souches mutantes par délétion, auxotrophe pour l'adénine ou le tryptophane. Le panel des 11 souches délétées est mis en culture parallèle sur 3 milieux différents
· Milieu complet - SDC

· Milieu complet sans adénine: SDC-Ade
· Milieu complet sans tryptophane: SDC-Trp

Les résultats observés sont probants, la baisse d'hybridation sur certains plots reflètent directement la pression de sélection, reflétant un phénotype quantitatif figure

Les avantages
Ce procédé présente quatre avantages

· Grâce à la grande sensibilité offerte par la détection de fluorescence sur les puces à haute densité, un grand panel de souches signées mutantes par délétion peut être étudié simultanément. (Nombre de souches potentielles > 6000).

· Les souches délétées le sont totalement. On n'observe donc pas d'activité résiduelle ou altérée causée par un produit tronqué.

· Les souches délétées avec des phénotypes intéressant sont identifiables directement grâce à la signature nucléotidique unique (tag), sans clonage ni séquençage supplémentaire.

· La nature quantitative des résultats d'hybridation permet de révéler de subtils phénotypes

qui aurait été occulté par une analyse subjective (de type: " Cela pousse "," Cela ne pousse pas " ou "cela pousse moyen "). Ici les résultats sont quantitatifs.
Sans cette technique de signature et d'hybridation sur puce, les mutants par délétions sont analysables uniquement de manière individuelle. La signature permet l'étude d'un grand panel de mutants et l'exemple de Shoemaker est transposable à de grand nombre de gènes dont on veut déterminer le rôle biologique.
L'avenir des bio-puces (10)
Les possibilités des puces à ADN sont inversement proportionnelles à leurs tailles.

Il se pourrait en effet, que des ARN artificiels soient effectivement capables de remplacer des anticorps monoclonaux et cela sans pour autant atténuer les affinités obtenues avec l'utilisation d'anticorps classiques. Une expérience de ce type à été réalisé dans le cadre d'une étude sur l'hormone TSH (Thyroïde Stimulating Hormone), ou encore à l'aide du mode de microscopie à champ proche qui a été essayé au cours du dosage de l'ACE (Angiotensine 1 Converting Enzyme).

Les puces à ADN devraient permettre l’accès aux immuno-analyses simultanées du même prélèvement pour le diagnostique moléculaire des maladies infectieuses ou encore, dans le cadre de recherche sur les résistances aux antibiotiques.

Les puces à ADN risquent de bouleverser les recherches en Génétique, grâce à la mise au point imminente de puces de polymorphismes dont les applications seront des plus

nombreuses:

- L'étude de la diversité génétique dans le cadre de la génétique des populations

- L'établissement de cartes génétiques affinées

- La recherche accélérée sur les maladies à origine génétique (Dépistage, Facteurs de risque ... )
Conclusion
Les différents aspects évoqués et présentés précédemment sont révélateurs des immenses potentialités des puces à ADN, ainsi que de l'avenir qui leur est promis. C'est pourquoi une fois l'ensemble des étapes clés de la fabrication telle que l'adressage ou l'analyse sera maîtrisé, l'unique frein à leurs perfectionnements sera le temps d'extraction ou encore le temps d'hybridation entre les deux brins, ce qui pour certains types de puces est déjà maîtrisé.

Bibliographie
(1) Technoscope de Biofutur 166, Avril 1997

(2) De la PCR aux puces à ADN, Biofutur 139,58, Novembre 1994

(3) La puce à ADN, Médecine et Sciences, Vol 13, 11, Novembre 1997

(4) Les puces à ADN, Industrie et technique, 789, Janvier 1998

(5) Cytogénétique et fluorescence, Biofutur, 165, 1997

(6) DD Shoemaker et al, Quantitative phenotypic analysis of yeast deletion mutants Nature Genetics, Vol 14, 450-456, 1996

(7) JG Hacia et al, Detection of Heterozygous mutations in BRCAI..., Nature Genetics, Vol 14, 441-447, 19%

(8) Site web d'Affymetrix : http://www.affymetrix.com/

(9) Polypyrrole DNA Chip on a silicon device : Exemple of Hepatitis C Virus Genotyping, Analytical B¼ochemistery, 255, 188-194, 1998

(10) Joseph Marchand, Des bio-puces pour la biologie médicale ?,Spectra-Biologie, (A para¼tre Juin 1998)

Remerciements
Nous tenons à remercier tout particulièrement Jospeh Marchand de Cis Bio International pour les documents qu'il a eu la gentillesse de nous faire parvenir.

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