Chapitre 2 – Transmission des caractères de l’hérédité








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date de publication27.01.2017
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Chapitre 2 – Transmission des caractères de l’hérédité.

I – Mécanismes du maintien de l’information génétique.
A) Introduction
- A chaque division, la cellule doit être capable de transmettre la même information génétique.
- Une bactérie se divise toutes les 20 minutes.
- Cette réplication de l’ADN implique des vitesses de polymérisation d’environ 
- Chez les bactéries : 500 nt/s
- Mammifère 50 nt/s
- Tout ceci nécessite une machine de réplication précise et rapide ainsi qu’un système de correction des erreurs.

B) Les mécanisme de réplication de l’ADN
1- Appariement des bases
- La réplication c’est le processus de copie à l’identique de l’ADN en 2 molécules filles.
- La brique de base qui forme l’ADN  Nucléotide Triphosphate de réplication.
- Nucléoside : Base + Sucre
- Nucléotide : Base + Sucre + phosphate.

2 - Réplication semi- conservative
- Réplication : Chaque brin de la double hélice d’ADN sert de matrice pour former un nouveau brin.
- 1 mole de 12C = 12 grammes.

3- Existence d’une fourche de réplication asymétrique.
- Nous avons vu que l’ADN présentait un modèle de réplication semi conservatif. Cependant, nous savons que cet ADN est composé des 2 brins d’orientation anti parallèles. La question est donc de savoir comment se fait la copie de cet ADN.
- Se fait-elle :
- Dans le même sens de progression de la fourche (c’est-à-dire de 5’  3’)
- Dans le sens inverse ?
- Dans des sens différents ?
- La Réponse à cette question est la 3° proposition : La réplication de l’ADN présente une fourche de réplication asymétrique. En effet, la réplication présente deux types de réplication :
- La réplication directe ou continue qui concerne le brin 5 ‘  3’
- La réplication indirect ou discontinue qui concerne le brin 3‘ 5’. La Réplication de ce brin nécessitera donc la synthèse de petits fragments que l’on va relier petit à petit.

4 – Un outil indispensable à la réplication : L’ADN polymérase ou ADNpol
- Toutes les ADNpol agissent de 5’ vers 3‘.
- Elles servent, entre autre à créer des liaisons entre nucléotides par décrochage d’un phosphate du triphosphate puis liaison d’un phosphate (lié à une base) au pyrophosphate formé précédemment.
- Les ADNpol ne peuvent fonctionner sans utiliser d’amorces. En effet, la réplication de l’ADN ne peut contenir des erreurs. Elles doivent donc être capables de vérifier l’appariement correct des bases de l’ADN et ce, grâce à l’amorce d’ARN.
- Cette amorce est un oligonucléotide qui sert de matrice et de point de départ à l’ADNpol pour synthétiser le brin complémentaire de cette matrice.
- Ce procédé découvert vers 1956, a donné lieu aux premières synthèses in vitro de brins d’ADN :

Principe de la réplication.
1) On chauffe la molécule d’ADN (>90 °C) Mise des amorces dans la solution.
2) Hybridation des amorces.
3) Ajout des ADNpol et des nucléotides.
4) Synthèse


- A chaque cycle de réplication, on multiplie la quantité d’ADN par 2 !

- Le problème est que l’ADNpol devait être changée à chaque cycle, puisque cette enzyme était dénaturée par la chaleur.
 Dans les années 2000, a été découverte dans des bactéries sous-marines une espèce d’ADNpol qui résiste à des températures supérieures à 90°C. Le problème était résolu !

- Grâce à cette découverte, les chercheurs ont pu développer un procédé rapide de réplication génétique : La PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Nous avons vu que l’ADNpol était un précieux outil réplication. Cependant, une sous unité de cette enzyme présente un autre but : celui de diminuer les erreurs de réplication de manière directe.
- En effet, l’ADNpol nécessite une amorce pour pouvoir initier sa réplication. Cependant, il se peut qu’une partie (terminale en générale) de cette amorce ne soit pas correctement appariée et donc entraine un défaut de placement de nucléotide.
- Une partie de contrôle de l’ADNpol va donc voir la mauvaise position du nt, la portion « exonucléase » de l’ADNpol va couper le nt mal apparié, l’éliminer, et apparier le bon nucléotide.
- Cette fonction exo-nucléasique se fait de 3’ vers 5’.

Moyen mnémotechnique pour savoir comment marche une ADNpol  main droite.


- Malgré tous les contrôles effectués par cette ADNpol, des erreurs peuvent subsister a raison d’une erreur tous les 1 milliards de nucléotides.

5 – Amorces initiales nécessaires à l’ADN polymérase
- Une seule fois pour le brin continu.
- Tous les 200 nt pour le brin discontinu.

6 – Nécessité de plusieurs composants.
6.1 - ARNpol primase pour la synthèse de l’amorce
- Les ARNpol n’ont pas besoin d’amorces pour travailler.
- Cette enzyme se localise sur l’ADN et synthèse une amorce d’ARN par polymérisation d’une dizaine de nt.
- Toutes les ARNpol (comme les ADNpol d’ailleurs) ont une fonction 5’-3’.

6.2 – RNAse
- Une fois la réplication terminée, la RNAse H va enlever l’amorce d’ARN.
- L’ADNpol va terminer son travail de synthèse en « bouchant le trou » qui vient d’être formé par élimination de l’amorce par la RNAse H. Cette réplication se fait vers l’extérieur dans le sens opposé du front de réplication, jusqu’au fragment d’Okasaki précédent.

6.3 - ADN ligase 
- Création de la liaison 3’-5’ de deux nucléotides adjacents dans une chaine.
- Elles sont capables, lorsqu’elles ont 2 extrémités de brins d’ADN (3’Phosphate et 5’OH), de former une liaison covalente.

- Fragment d’Okasaki : Fragments obtenu dans le brin retardé. 1 000 à 2 000 chez les bactéries 100 à 200 nt chez les eucaryotes.

7 - Protéine nécessaire pour ouvrir la double hélice
7.1- ADN Hélicase
- Séparation des deux brins d’ADN (déroulement) par utilisation d’énergie sous forme d’ATP.
- Cette enzyme travaille devant l’ADNpol.
- Elle a une forme annulaire.

7.2 – Protéine SBB
- Lorsque on sépare les deux brins d’ADN, un brin peut s’auto-associer par complémentarité de ces bases. Il existe donc une protéine qui empêche ce phénomène : les protéines SSB.
- Elles tapissent l’ADN double brin et empêche l’ADN simple brin de s’auto-hybrider.

8 – Machinerie de réplication constituée de protéines associées


9 - Mécanisme similaire pour les procaryotes et pour les eucaryotes.
- Bactérie : 1 ADNpol
- Eucaryotes : 2 ADNpol

C) Mécanisme de réparation de l’ADN
1 - Introduction
- Processus de protection de l’intégrité d’un ADN lésé.
- Il met en jeu le brin intact pour corriger l’erreur.
- Sur les milliers des changements de séquences qui surviennent au hasard dans l’ADN d’une cellule humaine, voici les principales causes d’erreurs :
- Chaleur
- accident de métabolisme
- Radiation de toutes sortes.

2 – Conservation et de mutation des séquences d’ADN
- Fréquence d’erreur : Une paire de base pour 1 milliard de nt formés correctement.
- Par conséquence d’un gène qui contient 103 paires de bases subiraient une modification toutes les 106 générations.

3 –Conséquences des mutations de l’ADN
- Dans les cellules germinales.
 Sinon pas de perpétuation de l’espèce.

- Dans les cellules somatiques
 Sinon développement de Cancer (Lymphomes, Myélome, Leucémie, Cancer du Côlon.)

II – Structure et réplication des chromosomes
A) Introduction
- Chromatine = Structure d’ADN chromosomique et de protéines chromosomiques qui lui sont associés dans le noyau.
- Variations dans l’organisation de la chromatine (Elle n’est pas figée.)
- Passage de l’Hétérochromatine (condensé) à l’Euchromatine (décondensée)

B) L’ADN au sein de chromosome
1 – Longue chaine d’ADN unique pour chaque chromosome.
- Un chromosome présente :
- un bras court.
- un centromère (qui joue un rôle dans la division cellulaire) : Constriction des chromosomes qui sépare le bras court et le bras long.
- un bras long
- 10% du bras long du chromosome (40 gène
- 1 % du gène long = 4 gènes.
- Un gène de 3,4.104 pb présentant des introns (partie non codantes) et exons (partie codante.)

- Télomères = Extrémités des chromosomes.

- Il existe des séquences non codantes en amont du gène qui décident si une ARNpol synthétise un ARN ou pas. Ces séquences régulent donc la transcription du gène.

2 – Pour chaque molécule d’ADN formant un chromosome
- Centromère.
- Deux télomères.
- Des origines de réplication : Séquence sur laquelle commence la réplication de l’ADN.

Trois éléments de la séquence d’ADN nécessaire à a réplication.
1– Séquence des origines de réplication.
2 -Séquence de télomère.
3- Séquence des centromères.
- Il n’y a pas de relation entre la complexité d’un organisme et sa longueur en ADN.
- Dans la nature, les espèces peuvent présenter des caryotypes de 10 à 100 Chromosomes.

3 - Définitions
Plasmide = épisome
.
1 - Fragment d’ADN extra-chromosomique circulaire.
2 - Séquence d’ADN pouvant soit exister sous une forme extra chromosomique autonome soit être insérée dans l’ADN chromosomique par extension, désigne les formes d’ADN auto réplicatives et extra chromosomique.

- Susceptible de se répliquer de façon autonome.
- Présent dans les bactéries.
- Peut porter des gènes de résistance aux antibiotiques.
- Transférable d’une bactérie à l’autre par conjugaison.
- Utilisés comme vecteurs en génie génétique.


Vecteur : Séquence nucléotidique qui est capable de s’auto-répliquer et qui peut être utilisé pour la recombinaison in vitro de l’ADN et son amplification extra-chromosomique. Il peut être un phage, un plasmide un rétrovirus…)

- Exon : La partie codante des gènes qui persiste après excision des ARN.

- Intron : La partie non codante partir d’un transcrit primaire qui est éliminé par épissage au cours de la maturation de l’ARN.

- Epissage (= Splicing) : Maturation des ARN : -Raboutage des exons
- Excision des introns.

- Transcrit : ARN produit par la transcription d’un gène sans préjuger de son degré de maturité.

- Gène : unité fonctionnel complexe pour la production régulé d’un ARN. C’est l’ensemble des séquences nucléiques qui contiennent l’information pour la production régulée d’un ARN particulier (transcription.) Chaque région de la double hélice d’ADN qui produit une molécule d’ARN fonctionnel est un gène.

- Il a fallu : - 10 ans pour répliquer un chromosome.
- 5 ans pour les autres chromosomes.
- En 2001: Première séquence d’ADN de TOUS les Chromosomes d’ADN.
- A l’heure actuelle on est capable de séquencer tout l’ADN d’un individu en 1 semaine.

C- Protéines de structure associées à l’ADN
1 - Les Histones : principales protéines de structure des chromosomes.
- Histone : Protéine constitutive de base de la chromatine. Présente uniquement dans les cellules eucaryotes.
- Deux groupes d’histone :
- Histone des Nucléosomes (structure de base de la chromatine) : H2A, H2B, H3 et H4
- Histone H1. Il n’est pas dans le nucléosome.

2 - Histone + ADN = Nucléosome
- Nucléosome : Structure de base de la chromatine constituée d’un octamère d’histone et d’environ 140 pb d’ADN enroulé deux fois autour de l’octamère.
- Diamètre du Nucléosome : 11 nm.

3 - Assemblage de l’Octamère.
- Un nucléosome est donc l’assemblage de 8 histones entourées de 2 tours d’ADN. Comment est-on arrivé à cette conclusion ?
- Principe :
- Digestion de l’ADN (à l’aide de nucléase). On isole ainsi, les parties de l’ADN non liées au Nucléosome.
- Dissociation (par solution saline à forte concentration) des liaisons ioniques qui attache l’ADN du nucléosome (On dissocie donc les restes d’ADN entourant le Nucléosomes.)
- Dissociation (par un détergent) des interactions hydrophobe entre les histones. (On individualise donc les différentes composantes du Nucléosome.)

4 - Enroulement de l’ADN en protéine serrées.
- Pour que les nucléosome permettent l’enroulement de l’ADN autour, elles sont une structure particulière. Cette structure se retrouve entre les histones, car la séquence des acides aminés d’une Histone est très proche d’une Histone à l’autre.
- Par conséquent, les acides aminés se replient tous de la même façon et peuvent donc être en relation les uns avec les autres.

5 - Complexe de remodelage de la chromatine dépendante de l’ATP
- La complexité de la structure d’un nucléosome est telle qu’une face particulière des Histones n’est pas accessible. Cette partie, c’est la partie des histones enroulées au cœur de l’ADN.
- On peut apercevoir, en moyenne  un nucléosome toutes les 200 pb.
- Longueur du segment d’ADN entre 2 nucléosomes : 0 à 80 pb.
- Un gène eucaryote de 10 000 pb est associé à 50 nucléosomes.
- Chez l’Homme : 6 milliards de pb = 30 millions de Nucléosomes.


6 - Compactage des nucléosomes dans la fibre de chromatine.
- La chromatine doit pouvoir se compacter et se décompacter rapidement.
- Il existe une machinerie de protéines capables de déplacer les nucléosomes afin de déplacer l’enroulement de l’ADN autour de ces nucléosomes et donc de rendre accessible certaines portions géniques.
- Certaines sous unités utilisent l’ATP et marchent comme des hélicases.


Décondensation de la chromatine expérimentalement par une solution très peu saline.
- On part d’une structure appelée « Fibre de 30 nm »pour arriver à la forme des nucléosomes.

- La question qui se pose alors c’est : « Quelle est la structure de cette fibre de 30 nm ? » :
- Modèle Zig-zag ?
- Modèle du Solénoïde ?
-Actuellement, on ne sait toujours pas quel modèle entre le zig-zag et le solénoïde est la meilleure.
- La protéine Histone H1 interagit avec le nucléosome pour compacter davantage la chromatine.

10 – Modifications covalentes réversibles de la queue des histones.
- Tous les histones qui constituent le nucléosome ont une extension N-terminal où viennent se fixer des enzymes qui ajoutent des groupements (Phosphate, Acétyl (CH3-CH2), Méthyl, Ubiquitine….)
-L’Ubiquitine est un groupement qui sert de signal de dégradation pour transfert vers le Protéasome.
- Une modification est gérée par 2 familles d’enzymes :
- Histone Acétyl Transferase (HAT) (ajout d’un groupement Acétyl sur une Lysine)
- D-Histone Acétylase (HDAC) : Qui enlève le groupement Acétyl.
L’acide Valproïque utilisé dans les maladies neurologiques  est une HDAC.

- Mono et di méthylation de l’arginine
- Phosphorylation des Sérines et desThréonines.
- Addition d’ADP ribose a l’acide Glutamique
- Outre l’addition d’Ubiquitine, Addition de sumo ou de Biotine à la lysine.

D – Diversité de structure et de fonctions de la chromatine.
1 –Existence de Variants d’Histones.
- Nous avons dit que les Histones étaient au nombre de 5. Cependant, il existe des gènes qui codent des histones similaires qu’on nomme « Variants d’histones ». Ces protéines extrêmement similaires au Histones.
- Variants de H3 : - H3.3 : Histone H3. Ils sont incrustés dans un endroit particulier du génome qui a une signification fonctionnelle. Lorsque certains gènes enrichi en H3.3, ils sont transcrits.
- CENP-A qui remplace le H3 au niveau des centromères il créé une surface d’interaction particulière.

- Kinétochore : Structure complexe formée de protéine sur un chromosome en mitose à laquelle les MT sont attachés.

- Variants de H2A : - H2AX : Que l’on détecte lorsque l’on a une réparation de l’ADN.
- HZAZ : Il est enrichi dans les nucléosomes où les gènes sont transcrits.

- Conclusion : Les histones ce ne sont pas seulement 5 protéines. Ils présentent également des modifications covalentes au niveau N-terminal des histones ce qui modifie leur fonction. Ils existent également des variants d’histones qui peuvent remplacer les histones dans la chromatine et conférer des propriétés particulières.

2 – Le « code des histones
- Action concerté des modifications covalentes réversibles des histones et des variants d’histone pour produire un code d’histone.
- Signification du codes d’histones.
 Méthylation de la lysine 9 = Signal que la partie du génome va former de l’hétérochromatine.

E – Organisation globale des chromosomes.
- La fibre de 30 nm uniquement = Un chromosome mesurerait 1 mm de longueur  C’est beaucoup trop !

1 – Repliement des chromosomes en série de domaine en boucle
1.1 - Cas des ovocytes amphibiens
- Visualisation des ovocytes à un état particulier du développement.
- Utilisation d’un réactif fluorescent : Boucles visualisables en MO. Une boucle mesure autour de 10 µm et est présent a une fréquence d’environ 10 000 boucles / Chromosome.

- Chromomère : Région d’un chromosome où la chromatine est la plus condensée.

- On peut fixer des sondes fluorescentes qui vont s’hybrider sur les parties complémentaires du génome. On ajoute toujours les mêmes séquences qui sont condensées et celles qui sont dans la boucle.
1.2 – Visualisation chez l’Homme : Capture de conformation de chromosome.
- Afin de préciser que le même système est présent chez les êtres humains, on va procéder autrement que chez les bactériens.
- Si l’ADN génomique forme une boucle il y a des régions de l’ADN qui vont être topologiquement proches. Pourtant, si on suit la séquence la séquence ils sont éloignés.

- On va donc ajouter du formaldéhyde sur une cellule (pour figer la cellule.) Ceci va former des pont covalents qui vont bloquer la boucle.
- Utilisation d’enzymes (Endo et Exo-nucléase qui vont digérer la préparation (les enzymes coupent l’ADN en morceau.)
 Il restera donc de ma boucle : Le début et la fin de ma boucle.
- Enfin, j’utilise une ligase qui va donner une boucle plut petite.

- On peut mettre des amorces de chaque côté de la boucle, on chauffe pour enlever le Formaldéhyde et on fait une PCR.
 On obtient un produit de PCR que si les deux séquences d’ADN sont suffisamment proches

- Les enzymes de modification des histones activent les protéines de remodelage de la chromatine, on obtient une boucle qui va être moins compactée. Les gènes pourront plus facilement s’exprimer.

- Glutaraldhéyde (ponts non réversibles)
-
Formaldéhyde (ponts réversibles par chauffage.)

2 – Protéines impliquées dans la condensation des chromosomes.
- Dans une cellule en mitose le chromosome est plier 10 000 fois plus que s l’ADN était déplié.
- Les boucles d’ADN sont accrochées à une armature protéique : Quels sont ces protéines ?
- Dimère de SMC : forment une pince qui sont assez grandes pour entourés un chromosome d’ADN.
- Condensines : Protéines dont la base structurelle est un dimère SMC.
- Association avec d’autres protéines pour réguler la capacité à pincer l’ADN.
- Cette pince est capable d’attraper plusieurs boucles et les obliger à rester ensemble.
- Ces pinces peuvent interagir les unes avec les autres via leur charnière. La structure finale est donc une organisation en rond à partir des boucles qui étaient linéaires. Les ronds regroupés les uns avec les autres ont une formation d’Hélice.
- Tout ceci est visualisable grâce à des anticorps couplés à de l’immunofluorescence. d’anticorps anti- Condensines qui vont se fixer sur les protéines de Condensines. La localisation des Condensines est donc bien au centre de la chromatine. On peut également visualiser les protéines de condensines en ME grâce à des particules d’or.
- Cohésines : Protéines SMC qui forment également une pince qui va englober des chromatides jusqu’à ce que les Kinétochores tirent le centromère vers les 2 pôles de la cellule
F) Réplication des chromosomes
1 – Introduction.
- L’ADN des procaryotes se réplique à la vitesse de 500 nt par seconde. La réplication est terminée en 40 minutes avec une seule origine de réplication
- L’ADN des eucaryotes se réplique à la vitesse de 50 nt par secondes.
 Pour répliquer la totalité d’un chromosome de 150 X 106 pb il faudrait plus de 800 heures. Mais il faut allait plus vite. Comment faire ?
- Accélérer la vitesse de réplication ?  Non car l’ADNpol ferait des erreurs.
- Copier à plusieurs endroits différents.

2 – Activation des origines de réplications par groupes.
- L’ADN est donc constituée de beaucoup de régions dites : « origine de réplication » 
Comment s’est-on rendu compte de ces nombreuses « origines de réplication » ?
- Principe : Marquage à la Thymidine (car seul spécifique de l’ADN a proprement dit). Si on étale sur une lame de verre le résultat et qu’on expose aux électrons, on a des marques noires qui montrent la réplication de l’ADN.
- En faisant une dilution isotopique on aura des marques noires, mais moins qu’avant ce qui permettra de savoir dans quel sens l’ADN se réplique. En effet, l’incorporation d’une T marquée sera beaucoup plus faible qu’une T non marquée. Par conséquent, on aura statistiquement une T non marquée au début de la réplication. La comparaison des deux expériences (Test 1 : Beaucoup de T marqués ; Test 2 : Dilution isotopique) permettra l’évaluation d’un sens de réplication à partir d’une Origine de réplication.

3 – Origine de réplication constitués de séquences d’ADN spécifique
- Juste à côté de l’endroit où l’ADN est séparé par l’Hélicase, il existe un complexe de protéines (ARS) qui va se fixer sur les origines de réplications (ORI)
- Les ORI sont riches en A et en T.
- Ces origines de réplications sont déterminées puisque il y a des protéines qui vont se fixer dessus de manière précise.
- Chez la levure, il y a 400 ORI (Origine de réplication.) – Expérience des levures avec ou sans gène créateur d’histidine.

- Thalassémie : Maladie génétique répandue dans les bassins méditerranéens où une chaine polypeptidique de l’hémoglobine est mal synthétisée.


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